cDNA文库构建常用指南 友名生物技术

DNA 连接酶是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA的copy和修复过程中起着重要的作用。DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA 连接酶，另一类是利用烟酰胺腺piao呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD* 的DNA 连接酶。

DNA连接酶（DNA Ligase）也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。连接酶的催化作用需要消耗ATP。

激酶、磷酸酶、磷酸化酶的区别？

激酶催化磷酸基团转移反应，比如己糖激酶。

磷酸酶催化磷酸基团的水解，与激酶正好相反。

磷酸化酶催化磷酸解反应，比如糖原磷酸化酶，催化糖原生成磷酸葡萄糖。这其实是磷酸解，要是水解就生成葡萄糖了。当然一般习惯上还是说水解。

激酶催化的反应一般也叫磷酸化，这没什么错误，只是和磷酸化酶容易混淆。

T4 RNA连接酶

用途：用RNA 3'末端标记；RNA和RNA分子间连接；寡核苷酸的环化；tRNA修饰；5' RACE中寡核苷酸连接到cDNA单链；在蛋白质特***点引入非天然氨基酸。

来源：由大肠杆1菌表达，表达***的来源为T4嗜菌体。

活性定义：37℃30分钟内，催化1 nmol 5'-[P]-(A)12-18成为磷酸酶不能消化的环形产物所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件：50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，10μM 5'-[P]-(A)12-18(10μM in 5'-termini)。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷1酸酯酶。

酶储存溶液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，50mM KCl，0.1mM EDTA，50%(v/v)glycerol。

Reaction Buffer(10X)：500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT。

cDNA是指具有与某RNA链呈互补碱基序列的DNA。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）作用而合成，并且在合成单链cDNA后，再用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶作用合成双链cDNA。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来的***组DNA相同而且无内含子；相反地，对应于在原来***中没有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，与外显子序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。